Preparación de grandes muestras biológicas para alta

Nature Protocols volumen 18, páginas 1441–1461 (2023)Citar este artículo

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La obtención de imágenes en diferentes escalas es esencial para comprender la morfología de órganos sanos y los cambios fisiopatológicos. La morfología tridimensional a macro y microescala de muestras grandes, incluidos órganos humanos intactos, es posible con microtomografía de rayos X (usando fuentes de laboratorio o sincrotrón). Sin embargo, la preparación de muestras grandes para imágenes de alta resolución es un desafío debido a limitaciones como la contracción de la muestra, el contraste insuficiente, el movimiento de la muestra y la formación de burbujas durante el montaje o el escaneo. Aquí, describimos la preparación, estabilización, deshidratación y montaje de grandes muestras de tejido blando para microtomografía de rayos X. Detallamos el protocolo aplicado a órganos humanos completos y tomografía de contraste de fase jerárquica en la Instalación Europea de Radiación Sincrotrón, pero es aplicable a una variedad de muestras biológicas, incluidos organismos completos. El protocolo mejora el contraste cuando se utilizan imágenes de rayos X, al tiempo que evita el movimiento de la muestra durante el escaneo, incluso con diferentes orientaciones de la muestra. Las burbujas atrapadas durante el montaje y las que se forman durante el escaneo (en el caso de imágenes de rayos X de sincrotrón) se mitigan mediante múltiples pasos de desgasificación. La preparación de la muestra también es compatible con la resonancia magnética, la tomografía computarizada y la observación histológica. La preparación y el montaje de la muestra requieren de 24 a 36 días para un órgano grande, como un cerebro o corazón humano completo. El tiempo de preparación varía según la composición, el tamaño y la fragilidad del tejido. El uso del protocolo permite escanear órganos intactos con un diámetro de 150 mm con un tamaño de vóxel local de 1 μm. El protocolo requiere usuarios con experiencia en el manejo de órganos humanos o animales, operaciones de laboratorio e imágenes de rayos X.

La cuantificación de la morfología de los órganos humanos, tanto en la salud como en la enfermedad, es una tarea compleja que puede abordarse mediante modalidades de imágenes espaciales multimodales, capaces de abarcar escalas dimensionales. La caracterización morfológica completa del tejido requiere la detección de interacciones entre y entre escalas; sin embargo, la mayoría de las técnicas de imagen están limitadas por la resolución o el campo de visión, lo que dificulta unir observaciones y datos macroscópicos con microscópicos. Los enfoques de histología convencional1,2,3 o microscopía electrónica4,5,6 permiten la visualización de la organización y composición microestructural del tejido a través de secciones seriadas, y los datos pueden cuantificarse adecuadamente; sin embargo, estos enfoques normalmente requieren la toma de muestras y el corte del tejido y requieren mucho trabajo y mucho tiempo. La limpieza óptica combinada con la microscopía de hoja de luz puede proporcionar un gran campo de visión con alta resolución; sin embargo, la limpieza de tejidos también requiere grandes escalas de tiempo y, a menudo, es costosa; además, la profundidad de la imagen para un microscopio de lámina de luz está limitada por la distancia de trabajo de la lente del objetivo7,8. Incluso cuando se han limpiado órganos humanos adultos completos8 o animales completos9 durante un período de varios meses, obtener imágenes de ellos sigue siendo un desafío. Se aplican inconvenientes similares a la tomografía de coherencia óptica10,11, la microscopía multifotónica12 o la microscopía confocal13,14, que pueden capturar la microestructura tridimensional (3D) local del tejido a escala celular, pero tienen una penetración tisular limitada, lo que dificulta la obtención de imágenes de tejido profundo15. Recientemente, la resonancia magnética nuclear (RMN) de alta resolución logró un tamaño de vóxel isotrópico de 100 µm en un cerebro humano completo ex vivo16. Aunque la resonancia magnética no es destructiva y tiene un gran campo de visión17, la resolución todavía no es suficiente para examinar la microestructura del tejido. Las técnicas de imagen jerárquica son capaces de superar el compromiso entre resolución y campo de visión. En un enfoque jerárquico, se adquieren múltiples imágenes de la misma muestra a diferentes resoluciones para unir las diferentes escalas. Se ha utilizado la tomografía microcomputarizada (µCT) para obtener imágenes de pulmones completos con una resolución de vóxeles de 150 μm, seguida de la extracción posterior de núcleos de biopsia en los pulmones; estos pequeños núcleos luego se escanearon con µCT para lograr vóxeles de 10 µm18.

Se ha logrado un progreso considerable en el campo de las imágenes de rayos X durante la última década, especialmente para la visualización de tejidos blandos19. La tomografía computarizada de rayos X sincrotrón (sCT, por sus siglas en inglés) ha demostrado ser una de las técnicas de imagen basadas en rayos X más poderosas debido a su alto brillo20, lo que permite la observación de tejidos blandos a alta resolución, con suficiente contraste para detectar componentes microestructurales21, como como neuronas individuales22 o fibras de elastina23. En particular, la sCT24 basada en contraste de fase, combinada con procedimientos optimizados de preparación y montaje de muestras, ha brindado amplia información sobre la orientación de las fibras cardíacas25,26 y, por separado, de los mapas celulares cerebrales27. Las imágenes de contraste de fase se refieren a la detección de cambios de fase de un haz de rayos X impartido por una muestra28. Esta técnica permite la visualización de tejidos blandos que serían indetectables con la tomografía de rayos X convencional en ausencia de un agente de contraste29. Sin embargo, los estudios que utilizan sCT se limitan principalmente a órganos fetales30, pequeñas submuestras de órganos humanos adultos31 u órganos de modelos animales pequeños, por ejemplo, ratón32 y conejo33, debido al campo de visión restringido. Algunos estudios han demostrado la obtención de imágenes de muestras más grandes, como celacantos con un diámetro que alcanza los 10 cm y una altura de 30 cm34,35; sin embargo, el tamaño de vóxel se limitó a 30 µm y la estructura de interés fueron tejidos duros o cartílagos.

Las fuentes de sincrotrón de cuarta generación, como la fuente extremadamente brillante de la Instalación Europea de Radiación de Sincrotrón (ESRF), proporcionan suficiente coherencia espacial y flujo de haz para visualizar órganos humanos intactos desde la macro a la microescala. Utilizando la fuente extremadamente brillante de ESRF, hemos desarrollado recientemente una técnica denominada tomografía de contraste de fase jerárquica36 (HiP-CT) que permite escanear grandes órganos humanos intactos con vóxeles isotrópicos de ~20 µm, con zoom posterior (sin seccionar), logrando hasta a vóxeles isotrópicos de 1 μm localmente. Aunque a menudo se pasan por alto, la preparación y el montaje de las muestras son cruciales para lograr las resoluciones más altas con esta y otras técnicas, especialmente cuando se visualizan muestras grandes de tejidos blandos, como órganos humanos, donde la relación entre el tamaño del vóxel y el diámetro del órgano es de 1:150 000 (1 µm). en 150 mm). El diámetro máximo imaginable está limitado por el equipo y los parámetros de configuración de la línea de luz, como el ancho del haz de rayos X, el tamaño del detector, la potencia informática disponible para reconstruir los datos y el tamaño de los datos. Actualmente, el diámetro máximo del órgano que hemos fotografiado es de 150 mm, pero la configuración actual sería compatible con un diámetro de hasta 250 mm por 500 mm verticalmente.

El éxito de todas estas técnicas experimentales depende de la preparación cuidadosa de la muestra para evitar artefactos de imagen. La obtención de imágenes de tejidos blandos con µCT o sCT presenta una serie de desafíos en comparación con los tejidos duros. Uno de estos problemas es la falta de contraste cuando se toman imágenes con rayos X debido a las densidades similares de los componentes de la muestra. Además, los algoritmos de retroproyección que se utilizan normalmente para reconstruir el volumen 3D a partir de proyecciones de rayos X suponen que la muestra no se mueve durante el escaneo. La mayoría de los métodos de preparación de muestras están diseñados para evitar la deriva o la deformación de la muestra, para evitar artefactos de movimiento que reducirían la calidad de las imágenes37. Se han desarrollado algunos algoritmos de reconstrucción, como la compensación de movimiento38,39 o los basados ​​en aprendizaje automático40,41, para superar este problema42, pero su funcionamiento sigue siendo complejo y computacionalmente costoso19.

Aunque el protocolo que describimos es aplicable a una amplia gama de muestras biológicas de diferentes tamaños y utilizando una variedad de modalidades de imágenes, aquí nos centramos en las muestras que se tomarán imágenes utilizando imágenes de contraste de fase de sincrotrón. El método también es aplicable a otras modalidades de imagen; sin embargo, es posible que sea necesario optimizar el procedimiento según el tamaño de la muestra y la modalidad elegida (consulte los pasos del protocolo para conocer las posibles recomendaciones de optimización).

El protocolo de preparación y montaje de muestras descrito en este documento se desarrolló a partir de la necesidad de obtener imágenes de grandes volúmenes biológicos, como pulmones, cerebro, corazón, riñón y bazo humanos intactos. La técnica permite escanear órganos completos con un tamaño de vóxel isotrópico de 25 µm. Luego, las áreas se seleccionan para escanear en alta resolución sin necesidad de biopsias. Para obtener imágenes de estructuras tan grandes, se requiere un haz de rayos X de alta energía para penetrar las muestras. Utilizamos un haz policromático con una energía que oscilaba entre 64 y 120 keV para obtener imágenes de órganos, pero las energías más altas (hasta 140 keV) serían óptimas, si estuvieran disponibles.

La preparación y estabilización del órgano para esta técnica es esencial, ya que cualquier falta de homogeneidad en la densidad, burbujas de gas o movimiento durante el escaneo reduciría en gran medida la calidad de la imagen. Durante el desarrollo del método, surgieron varios desafíos, como se describe en los datos extendidos Fig. 1. El atrapamiento de burbujas (durante el montaje) y la formación de burbujas (durante el escaneo), crean artefactos de desenfoque de movimiento y contraste de fase, y reducen la calidad del escaneo. Esto se resolvió limitando la dosis absorbida por la muestra e incluyendo múltiples pasos de desgasificación durante el procedimiento de preparación y montaje del órgano. El movimiento de la muestra durante el escaneo es un desafío adicional, particularmente porque las muestras son grandes y, por lo tanto, a menudo requieren mucho tiempo (> 5 h) para obtener la imagen. Este desafío se resolvió empaquetando cuidadosamente una mezcla de gel de agar triturado y líquido (en nuestro caso, etanol al 70 %) como medio de montaje alrededor del órgano. Además, la deshidratación del órgano con etanol aumentó el contraste de las imágenes43 y disminuyó la formación de burbujas.

Aquí, presentamos un procedimiento para preparar órganos humanos completos para obtener imágenes con sCT, µCT, CT médica y MRI que es compatible con una etapa final de histología incrustada en parafina clásica. En este protocolo, describimos principalmente la preparación de muestras y el montaje con etanol-agar; el protocolo de imágenes de rayos X usando HiP-CT y su aplicación a una aplicación médica (cuantificando el daño que la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) causa a la vasculatura pulmonar)44,45. En resumen, después de la fijación del cuerpo (Paso 1A(i)), los órganos se extraen (Paso 1A(ii–iii)), se fijan por inmersión (Paso 2), se deshidratan y desgasifican al vacío (Paso 4A) o ciclos térmicos (Paso 4B) dependiendo de su fragilidad, montado con una mezcla de gel de agar triturado (Pasos 5–33) y con imágenes usando sCT (Pasos 34–54), µCT (Paso 55), CT clínica (Paso 55) y MRI (Paso 55), y finalmente, se realiza el análisis histológico (Paso 56). Para obtener una descripción general del procedimiento, consulte la Fig. 1.

El protocolo contiene tres pasos principales (adquisición y preparación de órganos, montaje de órganos e imágenes) indicados en cuadros codificados por colores. El órgano se puede recuperar ya sea de un biobanco, una cirugía, un trasplante desestimado o se puede extraer de un cuerpo donado. Disponemos de dos protocolos de desgasificación en función de la fragilidad del órgano (desgasificación al vacío y desgasificación por ciclos térmicos). Una vez montada la muestra con el gel de agar, se pueden realizar diferentes técnicas de imagen (µCT, sCT, CT clínica y MRI). Después de la obtención de imágenes, se puede realizar una histología en la muestra.

Este protocolo fue desarrollado y optimizado para la preparación de órganos humanos completos para obtener imágenes de alta resolución con HiP-CT, como se muestra en la Fig. 2, y se ha aplicado a varios órganos, incluidos el cerebro, el corazón, los pulmones, los riñones y el bazo. Sin embargo, el procedimiento de preparación de órganos es flexible y se puede utilizar con tejidos blandos de origen animal o incluso con pequeños animales intactos. En Datos ampliados, Fig. 3, se proporciona una lista de órganos humanos y muestras biológicas obtenidas con este método y el tiempo de preparación para cada paso. el secado. Uno de los principales inconvenientes de la incrustación húmeda, como la inmersión alcohólica, es la deriva de la muestra, que crea artefactos de movimiento37. La inclusión en parafina y el secado en punto crítico modifican la estructura de la muestra para aumentar su rigidez, lo que permite que la muestra permanezca inmóvil durante un largo período de tiempo.

a, vista 3D del corazón humano fotografiado usando la línea de luz BM05 en ESRF. b–d, secciones transversales del corazón con un tamaño de vóxel isotrópico de 25 µm (b), 6,5 µm (c) y 2,5 µm (d). e, Ampliación de la imagen de 2,5 vóxeles con anotación de las principales estructuras observadas (ca, arteria coronaria; mc, miocitos; ad, tejido adiposo). Toda la información básica sobre el paciente del que se origina este órgano se proporciona en Datos ampliados Fig. 2. Todos los experimentos siguieron las normas éticas gubernamentales e institucionales pertinentes para experimentos con humanos.

En este protocolo, el movimiento de la muestra se evita mediante el uso de pequeños bloques de gel de agar y gel de agar triturado en equilibrio de densidad con el líquido de montaje, manteniendo la muestra en su lugar. Los escaneos tomados con varios meses de diferencia en la misma muestra preparada con nuestro protocolo de estabilización de órganos pueden registrarse simplemente usando una transformación rígida manual. Esto demuestra la estabilidad de este método durante largos períodos de tiempo. Un problema común a todos estos métodos de preparación de muestras es la contracción del tejido. Este efecto puede dificultar la cuantificación morfológica y dar lugar a análisis erróneos. Sin embargo, en comparación con la inclusión en parafina46,47 y el secado en punto crítico37,48, la contracción de la muestra en este protocolo se puede mitigar usando múltiples baños de etanol en concentraciones ascendentes de etanol43 hasta el 70 %, preservando así la morfología del tejido. Además, la deshidratación de la muestra con etanol asegura un mayor contraste con µCT43,49 o sCT50. Este protocolo de preparación de muestras es compatible con muchas técnicas de resonancia magnética, tomografía computarizada clínica e histología (después de imágenes 3D y desmontaje). Finalmente, mientras que el equipo de imagen específico puede ser especializado, el protocolo de preparación puede implementarse en cualquier laboratorio biológico con una campana de humos adecuada. El equipo y los materiales están fácilmente disponibles a través de proveedores científicos estándar, siendo el equipo más especializado una bomba de vacío y una cámara desecadora.

Aunque este procedimiento presenta varias ventajas en comparación con otros protocolos de preparación de muestras, se deben tener en cuenta algunas limitaciones.

El momento de los diferentes pasos del protocolo que implican la fijación y la desgasificación dependen en gran medida de la composición y el tamaño del tejido. En el presente procedimiento, damos ejemplos de tiempos para diferentes órganos humanos; mientras que sería necesario probar y verificar el tiempo para otros tipos de tejidos. En este protocolo se proporcionan algunas pautas para la optimización de los tiempos.

Si bien la fijación del órgano es fundamental para la conservación del tejido a largo plazo, altera las propiedades mecánicas51,52 y de difusión del tejido, lo que podría confundir otras mediciones. A pesar de aumentar el contraste de la imagen, la deshidratación con etanol también afecta las propiedades mecánicas del tejido43,53. Esto limita el uso de este método de preparación para pruebas in situ; sin embargo, al no fijar el tejido y reemplazar el etanol por agua, es posible utilizar imágenes in situ13,54. Por lo tanto, el protocolo podría ampliarse en el futuro para cubrir experimentos dinámicos y cuantificación de propiedades mecánicas en un corto período de tiempo (como se produciría la degradación biológica). Si el contraste proporcionado por el etanol no es lo suficientemente alto o no se adapta a las necesidades experimentales, se podrían usar varios agentes de contraste, como los agentes de contraste a base de yodo55 o tungsteno56 para aumentar el contraste general del tejido o resolver componentes específicos. de interés13,56. Si el gel de agar no fuera deseable para una aplicación en particular, podría reemplazarse con otro medio sólido o elástico que estaría en equilibrio con el líquido de montaje y relativamente amorfo en su estructura. Por ejemplo, en caso de montaje con etanol al 96%, se puede utilizar gel de cristal de vela transparente en lugar de gel de agar. En caso de montaje con agua, también se pueden utilizar bloques de gelatina o bloques de poliacrilamida.

Uno de los principales inconvenientes de los métodos de inclusión en húmedo es la formación de burbujas debido a la tasa de dosis o la acumulación de dosis en el caso de sCT57. Estas burbujas pueden mover o dañar la muestra, además pueden crear fuertes artefactos, reduciendo drásticamente la calidad de la imagen58. Aunque el burbujeo es un problema con otros métodos de preparación estándar, por ejemplo, la inclusión de parafina, no está presente con el secado de punto crítico. En este protocolo, el problema se mitiga mediante varios pasos de desgasificación durante el procedimiento, lo que retrasa la nucleación de burbujas durante la exploración y se mitiga aún más mediante el uso de rayos X de alta energía con fuerte contraste de fase. Sin embargo, solo unas pocas líneas de luz están equipadas para obtener imágenes de tejidos blandos a alta energía con suficientes propiedades de coherencia y capacidades de propagación. La coherencia espacial debe ser lo suficientemente alta como para que la distancia de propagación se pueda establecer para distinguir la variación de densidad de la muestra sin desenfoque geométrico. Para la tomografía de rayos X de baja energía, los pasos de desgasificación deben realizarse concienzudamente y la tasa de dosis debe controlarse aún más cuidadosamente debido a la fotodisociación de la molécula de agua.

El tejido biológico se puede recolectar por varios métodos. Si la muestra se toma directamente de un biobanco, cirugía o trasplante descartado (Paso 1B), se puede llevar directamente a la etapa de fijación de la muestra (Paso 2). Si los órganos provienen de un cuerpo donado, se debe realizar la extracción de órganos (Paso 1A(ii)). El embalsamamiento del cuerpo se lleva a cabo poco después de la muerte, antes de la extracción del órgano (por un médico autorizado). El cuerpo se fija inyectando formalina diluida en una solución que contiene lanolina en la arteria carótida derecha (Paso 1A(i)). Después de la evisceración, se asegura la fijación completa del órgano sumergiéndolo en formaldehído tamponado neutro al 4% (Paso 2). La duración de la fijación se define por el tamaño del órgano, por ejemplo, 4 días para un cerebro humano. Al eviscerar el órgano, asegúrese de eliminar la mayor cantidad de tejido circundante posible para reducir el tiempo de penetración del fijador en el órgano. El volumen de fijador también es importante, recomendamos un volumen de al menos cuatro veces el volumen del tejido.

Algunos órganos, como el pulmón, pueden requerir inflación. Esto puede lograrse parcialmente en la etapa de fijación usando la instilación de formalina en los pulmones bajo presión controlada59. El pulmón se perfunde con formalina al 4% a través de la tráquea usando una columna de agua de 30 cm, luego se puede ligar la tráquea para mantener la configuración inflada durante un período de 2 días. Posteriormente, el pulmón se sumerge en una solución de formalina al 4% después de la extracción. Una vez fijado, la sustitución de formalina por los sucesivos baños de etanol con bombeo al vacío se acopla a la inyección de etanol en los bronquios para mantener una forma 3D consistente. La presión estrictamente controlada con desgasificación de etanol actualmente no es posible con el protocolo propuesto, pero debería ser posible utilizando la circulación de etanol desgasificado instilado a una presión controlada. Nuestros resultados muestran que, incluso sin una inflación estrictamente controlada en la etapa de deshidratación del etanol, los datos aún tienen una gran utilidad científica.

El órgano se deshidrata con múltiples baños de etanol previamente desgasificados. La transición a etanol al 70% debe ser gradual para evitar el encogimiento43. Se eligió una concentración de etanol del 70 % como el mejor compromiso entre la contracción controlada y el contraste suficiente para observar las estructuras de interés mediante el contraste de fase; sin embargo, se puede utilizar una concentración final de etanol diferente según la aplicación. Durante este paso, se debe realizar la desgasificación para eliminar el gas libre y disuelto presente en el tejido para evitar la formación de burbujas o el aumento de volumen durante la obtención de imágenes. Para órganos humanos, presentamos dos métodos, dependiendo de la fragilidad del órgano para deshidratación y desgasificación. La desgasificación por vacío (Paso 4A(i–v)) se puede utilizar para la mayoría de los órganos (corazón, pulmón, hígado, riñón, bazo). El órgano se sumerge a temperatura ambiente (20 °C) en cuatro baños sucesivos de etanol predesgasificado de concentraciones del 50%, 60% y 70%, y luego un segundo baño al 70% para asegurar que se alcance el equilibrio. Se realiza una etapa de desgasificación entre baños. El equilibrio se alcanza generalmente en 4 días para cada concentración para un órgano humano como un pulmón o un corazón. La desgasificación se realiza con una bomba de vacío y un desecador mediante ciclos sucesivos hasta una presión absoluta entre 15 y 10 mbar. La desgasificación se considera adecuada cuando no se observa un fuerte burbujeo a 10 mbar. Como alternativa, se desarrolló un ciclo térmico (entre temperatura ambiente y 4 °C) (Paso 4B(i)) para órganos frágiles, como el cerebro humano, ya que se observó algún daño después de usar el método de desgasificación al vacío36 si las burbujas no podían encontrar una salida del cerebro. En este método se realizan cuatro ciclos térmicos sumergiendo el órgano en cuatro baños sucesivos de 50%, 60% y 70%, y un segundo 70% de etanol predesgasificado. Cada ciclo térmico consiste en sumergir el órgano en el baño de etanol altamente desgasificado a temperatura ambiente. El recipiente debe cerrarse con cuidado para evitar que queden atrapadas burbujas de aire. Luego se mantiene en un refrigerador durante 4-5 días a 4 °C. Durante este período, el gas disuelto se difundirá en el etanol circundante y las burbujas se disolverán progresivamente. Después de este tiempo, las soluciones y el órgano deben volver a la temperatura ambiente y se puede iniciar un nuevo ciclo utilizando un nuevo baño de etanol fuertemente predesgasificado. Para ambos métodos, el número mínimo de baños de etanol es de cuatro para alcanzar una concentración final del 70% sin tener una contracción sustancial. Los tiempos de inmersión deben adaptarse y optimizarse al tipo y fragilidad del órgano. El resultado de la desgasificación se puede probar haciendo una radiografía del órgano en su vaso sin los medios de montaje que se describen a continuación. Si todavía quedan burbujas visibles, se pueden realizar más ciclos térmicos con etanol al 70%. Los órganos con tejido adiposo, como el cerebro, requieren más tiempo para equilibrarse con etanol. En cada etapa, la deshidratación puede comprobarse agitando el recipiente con el órgano dentro y buscando rayas de diferente densidad (transparencia diferente) que se formen en la solución de etanol circundante, lo que indica la presencia de agua en el etanol.

La deshidratación de etanol es suficiente para observar las estructuras de interés con µCT y sCT cuando se usa contraste de fase; sin embargo, debería ser posible combinar este protocolo con el uso de un agente de contraste para resolver componentes específicos de la muestra o cuando se usan técnicas de imagen menos sensibles56. El agente de contraste debe ser miscible con etanol al 70% o debe aplicarse al órgano fijado antes de la deshidratación con etanol. Los agentes de contraste aumentarían la absorción de la muestra, lo que puede mejorar la formación de burbujas durante la obtención de imágenes si se utiliza un haz de rayos X de sincrotrón intenso.

En los casos en que la técnica de caracterización no sea compatible con el etanol (por ejemplo, resonancia magnética para difusión), se puede aplicar el mismo protocolo para la desgasificación y luego para el montaje utilizando agua con formalina a la concentración deseada. Para aplicaciones in situ que requieren condiciones cercanas a las biológicas, este protocolo también se puede usar solo con agua, pero las muestras se pueden usar solo durante unas pocas horas, ya que se produciría una degradación biológica. Deben tomarse aspectos de seguridad específicos (trabajar bajo una campana de humos adaptada en un laboratorio bien ventilado, usar guantes, bata de laboratorio, zapatos cerrados y gafas de seguridad) ya que las soluciones de formalina o etanol producen vapores peligrosos.

Uno de los principales problemas de la incrustación húmeda es la presencia de burbujas. Estos pueden provenir del protocolo de montaje (burbujas en los órganos o atrapadas en los medios de montaje) y/o de dosis muy altas de rayos X que dan como resultado la evaporación del etanol (en el caso de sCT). En ambos casos, pueden crear artefactos sustanciales (Fig. 3), y en caso de burbujeo por la dosis de rayos X, los movimientos de las burbujas durante el escaneo a menudo inutilizan los escaneos60,61. Las pruebas preliminares mostraron que la desgasificación de la muestra antes de la toma de imágenes elimina las burbujas atrapadas y retrasa la nucleación y el crecimiento de nuevas burbujas. Por lo tanto, se incorporaron varios pasos de desgasificación en el protocolo para mitigar la formación de burbujas.

a–d, Artefactos debido a la dosis de radiación (a,b) o a una burbuja estable atrapada durante el montaje (c,d). a, Una sección transversal de un hígado humano con numerosas burbujas que se han desarrollado debido a una absorción de dosis demasiado alta debido a un escaneo bloqueado con el haz encendido durante varias horas, causando artefactos en las imágenes. ba, artefacto de burbujas. b, Imagen de una sección transversal del hígado después de eliminar las burbujas mediante la desgasificación de la muestra con desgasificación al vacío. c, Una sección transversal de un cerebro humano con una burbuja atrapada durante el montaje. d, Un zoom en la burbuja atrapada dentro del cerebro. Las imágenes se obtuvieron en la línea de luz BM05 en ESRF. Todos los experimentos siguieron las normas éticas gubernamentales e institucionales pertinentes para los experimentos con humanos.

El propósito de este paso es mantener el órgano en posición durante el escaneo para evitar artefactos de movimiento y garantizar que se puedan realizar más escaneos en una etapa posterior con un buen registro rígido 3D entre escaneos/experimentos posteriores. El gel de agar no se puede preparar directamente con etanol al 70 %, sino que debe hacerse agregando lentamente polvo de agar agar en agua desmineralizada caliente agitada (~85 °C) hasta 20 g/L. Una vez disuelta por completo, la solución de agar agar se vierte en un recipiente adecuado y se deja enfriar durante varias horas. Una vez gelificada, la mezcla se puede cortar en cubos pequeños (Paso 8) y agregar a etanol al 96 % (6 L:2 L de etanol:agar agar) (Paso 9), asegurando una concentración final de etanol del 70 %. Después de desgasificar (Paso 12) y triturar una parte de los cubos de agar (Paso 14), la mezcla está lista para el montaje. Si se prefiere el montaje con formalina al etanol (p. ej., para mejorar el contraste con la resonancia magnética), el baño de etanol al 96 % se puede reemplazar por un baño de formalina al 4 %. El gel de agar se puede preparar previamente y almacenar en un recipiente hermético para evitar la reintroducción de gas en la solución después de su desgasificación. La cantidad preparada depende del tamaño del órgano y del recipiente utilizado para el montaje final. Un gel de agar preparado con etanol al 70 % garantiza una reducción drástica de la formación de burbujas durante la obtención de imágenes. Es importante utilizar un gel de agar triturado y no un gel de agar mezclado, ya que el gel mezclado no retiene la muestra con tanta firmeza como el gel de agar triturado y podría provocar movimiento durante la toma de imágenes. Inicialmente, solo se usaban cubos de agar para mantener la muestra en posición; sin embargo, se descubrió que los cubos eran demasiado rígidos, lo que creaba deformaciones donde entraban en contacto con la superficie de los órganos blandos, como los pulmones. Por lo tanto, los cubos solo deben usarse en la parte inferior y superior del recipiente. Se utilizan unos pocos centímetros para crear una base sólida y evitar la rotación de la muestra (Paso 16). Se utiliza agar triturado en el resto del recipiente para mantener la muestra en posición. La mezcla de agar triturado en el líquido de montaje (70% de etanol o 4% de formalina) debe agregarse al recipiente suavemente con un cucharón para evitar que queden atrapadas burbujas de gas durante el proceso (Fig. 4c). Se debe realizar una desgasificación rápida al vacío al menos tres veces al agregar el gel triturado de agar para eliminar las burbujas atrapadas. Estos ciclos de vacío deben realizarse idealmente hasta 15 mbar. Las dimensiones del recipiente deben ser lo más parecidas posible a la muestra para minimizar la cantidad de material que tiene que atravesar el haz de rayos X; sin embargo, el órgano no debe tocar el costado del contenedor para evitar artefactos en las imágenes que comprometerían la precisión de la reconstrucción (es decir, un mínimo de 5 mm de gel de agar triturado debe rodear el órgano para evitar el contacto directo con el contenedor) . Para sCT, el contenedor utilizado para el montaje debe ser de un material resistente a los rayos X y no demasiado denso, como el tereftalato de polietileno. Debe evitarse el vidrio, ya que su alta densidad en comparación con las muestras daría lugar a fuertes artefactos de contraste de absorción. Una vez que el gel de agar se ha compactado alrededor de la muestra (Paso 22) y se ha desgasificado correctamente, el recipiente se puede sellar con una tapa hermética (Paso 28). El montaje debe evaluarse para garantizar que no sea posible el movimiento de la muestra en el recipiente y que no se vean burbujas en el interior. Si quedan atrapadas algunas burbujas, se puede utilizar una desgasificación rápida al vacío para eliminarlas. Se puede usar el mismo enfoque para eliminar las burbujas en un órgano en caso de un evento de formación de burbujas debido a una dosis alta durante la tomografía computarizada (sCT) (no desgasifique el recipiente sellado, retire la tapa, coloque un tamiz plano rígido sobre el gel de agar para evitar movimiento del órgano y luego desgasificar, complementar el nivel de etanol si éste disminuye y eventualmente agregar una pequeña cantidad de gel de agar triturado, luego cerrar nuevamente). En el video complementario 1 en línea se muestra un ejemplo de agar insuficientemente compactado. Con el órgano fijado y colocado en etanol al 70 %, la muestra puede almacenarse durante años (Fig. 4d).

a) Desgasificación del órgano en su recipiente mediante desecador y bomba de vacío. b,c, Después de la compactación del gel de agar presente en el recipiente, se elimina parte del etanol con una jeringa y un tamiz (b), luego se agrega el gel de agar (c). Este proceso continúa hasta que el gel de agar se comprime lo suficiente alrededor de la muestra para mantenerla en su posición. d, Muestra montada, estabilizada y desgasificada en gel de agar, lista para escanear. e, Esquema de un cerebro montado, como en d, fijado con el gel de agar triturado y cubos de agar, en un recipiente sellado. Todos los experimentos siguieron las normas éticas gubernamentales e institucionales pertinentes para los experimentos con humanos. Panel e imagen del cerebro de Smart Servier Medical Art (https://smart.servier.com/) con licencia CC BY 3.0.

La imagen de rayos X y la reconstrucción 3D no se describen en detalle en este protocolo; sin embargo, una descripción detallada está disponible en la literatura36 o contactando a los autores correspondientes. Este método se desarrolló para imágenes de órganos grandes con HiP-CT, pero muchos aspectos serían beneficiosos para imágenes más clásicas de sCT y μCT (fuente de laboratorio) en muestras más pequeñas, incluida la inmovilización y la mejora del contraste vinculada a la preparación con etanol. Una vez que se monta la muestra, la exploración se puede realizar en cualquier momento, con resultados típicos de imágenes de sCT de un corazón humano intacto que se muestran en la Fig. 2. La principal limitación de esta técnica es la nucleación y el crecimiento de burbujas después de la aplicación de dosis altas. Radiografía al órgano en el caso de sCT. Si solo aparecen unas pocas burbujas durante la toma de imágenes, la muestra se puede dejar en un refrigerador a 4 °C para disolverlas nuevamente. Si esto no tiene éxito, la muestra se puede volver a desgasificar con bombeo de vacío sin tener que desmontarla, pero inevitablemente habrá algunos pequeños movimientos de la muestra durante el proceso, lo que complica el procedimiento de escaneo y registro multiresolución. Existen varias soluciones para evitar la formación de burbujas durante la sCT, para la optimización de la detección, el aumento del contraste relativo para trabajar con dosis más bajas, un mejor control de la dosis, un mejor procesamiento de datos o tener un período de descanso para las muestras entre escaneos sucesivos de las mismas. área. El burbujeo parece estar fuertemente relacionado con el efecto térmico de la dosis sobre la tasa de evaporación del etanol. Desarrollar cámaras ambientales de muestra para trabajar a una temperatura más baja y garantizar un mejor equilibrio térmico puede ser una forma eficiente de aliviar el riesgo de burbujeo relacionado con el uso de etanol al 70 %, especialmente para exploraciones de resolución submicrónica múltiple en el mismo órgano.

El método de preparación de muestras que se presenta en este protocolo es compatible con la resonancia magnética (Fig. 5c), lo que lo hace muy adecuado para estudios multimodales. Sin embargo, se deben tener en cuenta una serie de consideraciones antes de decidir el método de preparación de muestras y el orden de escaneo. La deshidratación de la muestra con etanol aumenta el contraste de las imágenes de rayos X, pero puede afectar las imágenes de RM62. La mayoría de las técnicas de RM dependen en gran medida del contenido de agua. Así, al deshidratar la muestra, se mejora el contraste entre los tejidos que retienen bien el agua (p. ej., tejido adiposo) y los que se deshidratan eficientemente (p. ej., tejido muscular). Sin embargo, al disminuir el contenido total de agua, la señal se reduce y algunas técnicas, como la RM ponderada por difusión, ya no son posibles. Un método para superar este problema es no deshidratar la muestra, sino preparar la muestra directamente en un soporte de formalina para realizar primero la IRM. Entonces se reduce el contraste de las imágenes de sCT, pero aumenta la relación señal-ruido de las imágenes de MRI. Aunque el tejido fijado en formalina o paraformaldehído es el método de preparación de muestras más utilizado para la RM ex vivo, esta técnica también afecta a la calidad de las imágenes63. La fijación de tejido con formalina o paraformaldehído reduce T1, T2 y la difusividad del tejido, lo que reduce el contraste con el ruido en las imágenes. Un enfoque es lavar el cerebro para eliminar el fijador antes de la resonancia magnética, lo que puede restaurar los valores de T2 previos a la fijación, aunque no los de T1 (ref. 64). El lavado también pondrá en peligro los pasos de desgasificación anteriores, por lo que la importancia relativa de cada modalidad de imagen debe sopesarse cuidadosamente frente a la canalización de imagen general y los requisitos de registro multimodal.

a, vista 3D del riñón humano. b, Corte transversal del riñón fotografiado con TC médica, con un tamaño de vóxel de 625 µm. c, Corte transversal del riñón fotografiado con una resonancia magnética médica 3T, con un tamaño de vóxel de 220 × 200 × 200 µm3. d, Sección transversal del riñón fotografiado con sCT, con un tamaño de vóxel de 25 µm en la línea de luz BM5 ESRF. e, Comparación de sCT y una sección histopatológica teñida con hematoxilina y eosina (H&E). La histología se realizó después de todas las demás modalidades de imagen. Las técnicas histológicas utilizadas son estándar y están bien documentadas en la ref. 72. La columna de la izquierda muestra imágenes de micrografía óptica de secciones histopatológicas teñidas con H&E, la columna de la derecha muestra imágenes sCT 2D tomadas en la línea de luz BM05 en ESRF con un tamaño de vóxel de 1,4 μm. Las imágenes con una estrella en la parte superior izquierda han sido pseudocoloreadas (de sCT) o convertidas a niveles de gris antes de invertirse en contraste (de histología). Toda la información básica sobre el paciente del que se origina este órgano se proporciona en Datos ampliados Fig. 2. Todos los experimentos siguieron las normas éticas gubernamentales e institucionales pertinentes para experimentos con humanos. Panel e adaptado con permiso de ref. 36, Springer Naturaleza América, Inc.

El protocolo descrito aquí requiere experiencia previa en el manejo de órganos humanos o animales. Si se utilizan órganos humanos, un patólogo debe ser parte del estudio para manejar el embalsamamiento del cuerpo y la disección de órganos. La desgasificación del órgano, la preparación de la solución de agar y el montaje del órgano requieren la experiencia de un técnico de laboratorio, ya que estos pasos implican el manejo de materiales peligrosos como formalina y solución de etanol. Este protocolo fue desarrollado y optimizado para obtener imágenes de órganos grandes, se requiere un científico que tenga experiencia en CT o sCT, ya que obtener imágenes de estructuras tan grandes no es trivial.

Todos los experimentos aquí descritos fueron autorizados por la ESRF, el Laboratoire d'Anatomie des Alpes Françaises y el Hannover Institute of Pathology en Medizinische Hochschule, Hannover (voto de ética n.º 9022_BO_K_2020). Los protocolos de transporte e imagen fueron aprobados por la Autoridad de Investigación Sanitaria y el Sistema Integrado de Aplicación de la Investigación (200429) y el Ministerio de Sanidad francés. Todas las disecciones de órganos respetaron la memoria del difunto. El estudio post-mortem se realizó de acuerdo con las recomendaciones de la escala Quality Appraisal for Cadaveric Studies65.

Se deben buscar y seguir las reglamentaciones éticas institucionales y gubernamentales sobre el uso de tejido humano en la investigación antes de realizar cualquier procedimiento descrito en este protocolo. Los requisitos específicos serán fijados por las autoridades correspondientes. Por lo general, después de identificar una muestra adecuada, ya sea de una donación de cuerpo o de un biobanco, un comité de ética debe revisar el proyecto. Una vez aceptado el proyecto, se deben establecer contratos y/o Acuerdos de Transferencia de Material (MTA) para transferir los bioespecímenes entre instituciones. El tiempo necesario para obtener el acuerdo ético y el MTA puede ser considerable (varias semanas a años), dependiendo de los países involucrados y las especificidades del contrato.

Órganos humanos obtenidos de un cuerpo donado

Se deben seguir las normas éticas institucionales y gubernamentales relativas al uso de seres humanos para la investigación científica.

Formalina tamponada neutra al 4 %, (50 % Hygeco, n.° de cat. 07040 + 50 % Hygeco, n.° de cat. 07020; diluido al 4 %)

Tóxico, cancerígeno, mutagénico, reprotóxico e inflamable. Manipular con cuidado, en campana extractora. Evite la inhalación y la exposición a la piel o los ojos.

Etanol 96% (Cheminol France, cat. no. 20× 4-2)

Agar Agar (Nature et Aliments, cat. no. 510190)

Las propiedades gelificantes del agar difieren según el productor. Recomendamos utilizar el proveedor mencionado para reproducir los resultados presentados aquí. Si se utilizan otros, se requerirán algunas pruebas preliminares.

Agua desmineralizada (Sigma Aldrich, nº de cat. 38796)

Campana de humos (Laboratorio Iberis, n.º de cat. SPR18)

Guantes de nitrilo (Showa, n.° de cat. 7500PF)

Toallas de papel (Paredes, cat. no. 404857)

Instrumentos de disección (Fisher Scientific, n.º de cat. 11738551)

Bomba de vacío (Marshall Scientific, n.° de cat. VME8)

Desecador de vacío (SP Bel-Art, n.° de cat. F42400-4031)

Frigorífico (Fisher Scientific, nº de cat. 22651264)

Recipiente grande a prueba de fugas en tereftalato de polietileno (Medline Scientific, n.° de cat. 129-0592, o Lock & Lock, n.° de cat. INL-403 o Lock & Lock, n.° de cat. INL-203, que se muestra en la Fig. de datos ampliados .4)

Sistema de vórtice magnético equipado con placa calefactora (Fisherbrand, n.° de cat. 15349654)

Rallador eléctrico (Seb, cat. no. DO201141)

Cucharón (Tefal, n.º de cat. K1180214)

Cuchillo largo (Ikea, n.º de cat. 402.947.22)

Jeringa de 50 ml (PentaFerte, nº de cat. 002022960)

Tamiz (Profilstore, n.º de cat. toilinox_PGRI1ME213)

Cinta de vinilo de uso general (3 M, n.° de cat. 764)

Taladro (DeWALT, n.º de cat. DCD791P2-QW)

Portacontenedores (a medida, descrito en Datos Ampliados Fig. 5 y en la ref. 36)

Montaje de microtomografía sincrotrón. Utilizamos las líneas de luz BM05 y BM18 del ESRF. Los parámetros de la línea de luz de todos los escaneos de órganos presentados en este documento se detallan en Datos extendidos Fig. 6.

Reconstrucción de datos: Dell EMC PowerEdge R7525 Rack Server (sistema operativo: Ubuntu 20.04.3 LTS; unidad central de procesamiento: AMD EPYC 75F3 2,95 GHz, 64 núcleos; memoria: DDR4-3200 32 GB (32×); unidad de procesamiento de gráficos: NVIDIA Ampere A40 ×2; disco duro: 2,4 TB 10 K RPM SAS 12 Gbps)

Visualización de datos: Torre Dell Precision 7920 (sistema operativo: Windows Server 2016; unidad central de procesamiento: procesador Intel Xeon Platinum 8160 M, 2,10 GHz, 24 núcleos; memoria: 1,5 TB; unidad de procesamiento de gráficos: NVIDIA Quadro P6000; disco duro: AVAGO MR9460 -16i SCSI 4,67 TB)

Código de reconstrucción escrito internamente usando MATLAB 2017 disponible en GitHub (https://github.com/HiPCTProject/Tomo_Recon)

PyHST2 (código de reconstrucción tomográfica 3D, http://ftp.esrf.fr/scisoft/PYHST2, código abierto) desarrollado por ESRF

ImageJ/Fiji (preprocesamiento y posprocesamiento de datos, https://imagej.nih.gov/ij/, http://fiji.sc/, fuente abierta)

VGSTUDIO MAX versión 3.5 (segmentación y visualización de volumen, https://www.volumegraphics.com/en/products/vgsm.html)

Cualquier experimento que involucre el uso de órganos humanos debe ser aprobado éticamente por los comités institucionales o gubernamentales correspondientes.

Recoger el órgano de interés ya sea extrayéndolo de un cuerpo donado (opción A) o a través de un biobanco, una cirugía o un trasplante desestimado (opción B).

Embalsamamiento del cuerpo y extracción de órganos

Duración ~3 días

(Opcional) Embalsamar el cuerpo después de la muerte mediante la inyección secuencial de 4500 ml de formalina diluida al 1,15 % en una solución que contiene lanolina y 4500 ml de formalina diluida al 1,44 % en la arteria carótida derecha (realizada por un médico matriculado), idealmente con un drenaje yugular .

La formalina es volátil y altamente tóxica. Es un irritante para los ojos, las vías respiratorias y la piel y un probable carcinógeno. Trabaje dentro de una campana de humos químicos en un área bien ventilada y use equipo de protección personal adecuado (guantes, protección para los ojos y bata de laboratorio).

El cuerpo se puede almacenar hasta 2 años si se fija y refrigera adecuadamente.

Extraiga los órganos de interés del cuerpo.

Retire la grasa circundante y el tejido conectivo.

Obtención de órganos de un biobanco

El tiempo depende de los retrasos administrativos y de entrega.

Recuperar el órgano de un biobanco, una cirugía o un trasplante desestimado. El tiempo entre la recuperación del órgano y la fijación en formalina debe ser mínimo. Mientras tanto, el órgano debe mantenerse a 4 ° C para evitar la degradación del tejido. Los datos de los donantes deben ser anonimizados de acuerdo con las regulaciones gubernamentales. El órgano debe ser transportado en un contenedor sellado.

Tiempo 4 d

(Opcional) Fijar completamente el órgano sumergiéndolo en formalina tamponada neutra al 4% a temperatura ambiente. Utilizamos 4 d para la fijación con formalina para cumplir con las normas de seguridad vinculadas a las autopsias en caso de agente patógeno (como COVID-19). Recomendamos que el volumen de formalina sea al menos cuatro veces mayor que el volumen del órgano. El volumen es estimado por el patólogo, para quien esta es una práctica habitual.

La desgasificación con una bomba de vacío debe realizarse bajo una campana de humos o en una habitación equipada con un sistema de ventilación de capacidad suficiente para evitar la inhalación de gases de formalina o etanol.

La temperatura ambiente se fijó típicamente a 20 °C.

(Opcional) Lave la muestra con agua del grifo durante 2 min para eliminar el fijador.

Preparar el órgano para el montaje por deshidratación utilizando múltiples baños de etanol y desgasificación al vacío (opción A). Con el protocolo de desgasificación al vacío, se pudieron ver daños en algunos órganos frágiles (típicamente el cerebro). Por lo tanto, se desarrolló un protocolo alternativo para preparar la muestra sin desgasificación al vacío mediante ciclos térmicos (opción B). El etanol se puede reemplazar con una solución de formalina al 4% para evitar la deshidratación de la muestra cuando esto no es deseable, por ejemplo, en imágenes de RM o en el caso de imágenes de rayos X con contraste cercano a las condiciones biológicas. Es posible que sea necesario modificar este procedimiento, ya que el tiempo y el número de ciclos dependen en gran medida de la composición y el tamaño del órgano. Para muestras de diferente origen, tipo y tamaño, se debe considerar alguna optimización de este paso.

Deshidratación y desgasificación al vacío

Tiempo 16 d

Sumergir el órgano en un baño de etanol al 50% previamente desgasificado. La solución debe ser al menos cuatro veces el volumen del órgano.

Colocar el recipiente con el órgano dentro de un desecador.

Retire el gas libre y disuelto en el tejido disminuyendo la presión en ciclos sucesivos utilizando una bomba de vacío de diafragma hasta que se produzca un fuerte burbujeo.

Los primeros ciclos suelen durar de 2 a 3 minutos y alcanzan los 15 a 30 minutos después de tres o cuatro ciclos para un órgano humano, como un corazón o un riñón.

estos tiempos dependen en gran medida de la configuración de vacío del usuario.

Continuar estos ciclos hasta alcanzar 15–10 mbar sin fuerte burbujeo.

La desgasificación debe realizarse en ciclos de mayor duración. Para cada ciclo, el bombeo de vacío se detiene cuando el burbujeo se vuelve repentinamente más intenso. Cada vez que comienza un nuevo ciclo, el tiempo antes de la formación de la primera burbuja debe aumentar. El tiempo de desgasificación tiene que adaptarse a cada órgano en función de su composición y tamaño. No hay un tiempo típico, tiene que elegirse empíricamente observando el régimen de burbujeo. Esto dependerá en gran medida de la bomba de vacío y la calidad del desecador.

Solución de problemas

Espere hasta el equilibrio (nuestras pruebas muestran que típicamente 4 días para un órgano humano como un pulmón, corazón o cerebro es suficiente para cada concentración de etanol; con solo 2 días, vimos un equilibrio incompleto visible como gradientes de densidad en las exploraciones).

Repita los pasos (i–vi) con tres baños sucesivos de etanol predesgasificado al 60 %, 70 % y finalmente al 70 % con una desgasificación entre cada baño.

Realice una desgasificación final del órgano durante unos minutos justo antes de montarlo con el gel de agar-agar triturado en el frasco de montaje.

Deshidratación y desgasificación por ciclos térmicos (protocolo alternativo para órganos frágiles)

Tiempo 27 d

Deben realizarse al menos cuatro ciclos térmicos cada uno en concentraciones sucesivamente mayores de 50%, 60%, 70% y 70% de etanol.

Para cada concentración sucesiva, use la bomba de vacío para desgasificar un volumen de etanol de al menos cuatro veces el volumen del órgano, a temperatura ambiente.

Agregue el etanol al recipiente con la muestra y cierre el recipiente con cuidado para evitar que queden burbujas atrapadas.

Almacenar a 4 ° C durante 5 d. El gas disuelto se difundirá en el etanol circundante y las burbujas se disolverán progresivamente. Los tiempos de inmersión deben adaptarse y optimizarse al tipo y fragilidad del órgano.

Para cada ciclo, retire el recipiente del refrigerador para que vuelva a estar a temperatura ambiente (~12 h). Se puede usar un termómetro para medir la temperatura de la solución.

El resultado de la desgasificación se puede probar haciendo una radiografía del órgano en su vaso sin los medios de montaje que se describen a continuación. Si todavía quedan burbujas visibles, se pueden realizar más ciclos térmicos con etanol al 70%. Los órganos con tejido adiposo, como el cerebro, requieren más tiempo para equilibrarse con etanol.

Una vez en etanol al 70 %, el órgano se puede almacenar a temperatura ambiente durante meses o años antes de continuar con los pasos de montaje del protocolo.

Solución de problemas

Temporización 12 h a 2 d

Lo siguiente produce 5 L de gel de agar:

Hervir 5 L de agua desmineralizada en un recipiente utilizando una placa caliente equipada con un sistema de vórtice magnético.

El agua hirviendo o el vapor pueden causar quemaduras graves. Nunca lleve el recipiente lleno a mano. En su lugar, arrástrelo en un carrito o plataforma rodante. Use equipo de seguridad (guantes, bata de laboratorio, zapatos cerrados y gafas de seguridad) y trabaje en una habitación bien ventilada.

Una vez por encima de 80°, vierta lentamente 100 g de agar agar (20 g/L) en polvo en el agua y mantenga el vórtex hasta una buena disolución.

Una vez disuelto, detener la agitación y retirar el agitador con un cucharón.

Vierta el líquido en un recipiente grande. Normalmente, utilizamos un contenedor de 40 × 30 × 12 cm.

El agua hirviendo o el vapor pueden causar quemaduras graves. Use equipo de seguridad (guantes, bata de laboratorio, zapatos cerrados y gafas de seguridad) y trabaje en una habitación bien ventilada.

Una vez lograda la gelificación (~12 h dependiendo de la temperatura), cortar el gel de agar con un cuchillo largo en cubos de ~2 cm3.

Usa los cuchillos con cuidado y siempre concéntrate en lo que estás haciendo.

Sumergir los cubos en 11,7 L de etanol al 96% en un recipiente de 20 L. La relación de volumen se elige para asegurar una concentración final de etanol del 70%. Si el órgano se preparó con solución de formalina al 4% en lugar de etanol para evitar la deshidratación de la muestra, reemplace el etanol al 96% con formalina al 4%.

El etanol es inflamable, manténgalo alejado de fuentes de calor y tenga siempre a mano un extintor de incendios. La manipulación de etanol o formalina siempre debe realizarse bajo una campana extractora. Evite la inhalación y la exposición a la piel o los ojos. Utilice equipo de seguridad (guantes, bata de laboratorio, zapatos cerrados y gafas de seguridad). Espere hasta que la densidad de los bloques esté cerca de la del etanol (~ 24 h).

Compruebe el equilibrio de la solución agitándola para poner los cubos de gel en suspensión y asegurarse de que se hunden lentamente hasta el fondo del recipiente (durante varias decenas de segundos).

Coloque el recipiente con los cubos de agar y el etanol en el desecador. Para cerrar el desecador, coloque la tapa y cierre lentamente aplicando una fuerza leve. Gire con cuidado la tapa en ambas direcciones para asegurar un sello hermético. Asegúrese de que el desecador esté conectado a la bomba de vacío.

Desgasifique la solución usando la bomba de vacío durante dos ciclos de ~ 1 h para evitar romper los cubos de agar. Los cubos deben mantenerse sumergidos durante el proceso para evitar la deshidratación. Evite exponer los cubos al aire durante más de 10 min. Guarde un tercio de los cubos desgasificados con etanol al 70%, en un recipiente hermético.

Triture los cubos restantes con un rallador eléctrico.

El uso de equipos eléctricos con etanol al 70% es un riesgo de incendio, el dispositivo eléctrico en cuestión debe tener un motor con protección contra chispas y seguir las normas contra incendios adecuadas.

Almacene en un recipiente hermético para uso futuro con suficiente solución de etanol al 70 % para garantizar que no quede agar fuera de la solución.

Desgasifique la solución nuevamente justo antes de usarla.

Temporización ~3 h

Llene el fondo del recipiente cilíndrico a prueba de fugas con cubos de agarosa de unos pocos centímetros de largo/ancho. El contenedor se muestra en los datos extendidos Fig. 4.

Llene la mitad del recipiente con gel triturado.

Utilice un cucharón con movimientos lentos y cuidadosos cuando manipule la solución de agar para evitar que aumente el gas disuelto en la solución o que queden burbujas atrapadas.

Sumerja con cuidado el órgano en el gel y colóquelo en la posición deseada para obtener imágenes. Cubrir el órgano con agar triturado.

Desgasifique todo el recipiente para eliminar las burbujas atrapadas.

Este paso de desgasificación solo tiene como objetivo eliminar las burbujas atrapadas. Como todos los componentes se desgasificaron antes, esto debería limitar la cantidad de gas disuelto. Esta desgasificación al vacío debe realizarse solo con tiempos de bombeo breves (2 a 3 min) durante varios ciclos para ayudar a eliminar las burbujas visibles.

Golpear suavemente el desecador puede ayudar a que las burbujas viajen hacia la parte superior

Agregue más solución de agar-etanol.

Use un tamiz para presionar el gel de agar desde la parte superior para compactarlo alrededor del órgano. Use una jeringa para eliminar el exceso de etanol de la parte superior del tamiz, luego agregue un volumen de agar y etanol equivalente a una cuarta parte del recipiente.

Tenga cuidado ya que una vez que el agar está compacto, las burbujas no pueden subir fácilmente a la parte superior y, por lo tanto, ya no se puede realizar la desgasificación en esta parte del recipiente. Todos los movimientos deben realizarse lentamente y con cuidado para asegurarse de no atrapar burbujas al compactar el agar.

Aplique presión vertical manualmente alrededor de la muestra para compactar el agar alrededor de la muestra y mantenga la muestra en posición hasta que ya no se pueda mover en el frasco.

Deben dejarse al menos 5 mm de gel de agar triturado entre la muestra y la pared del recipiente para evitar efectos de borde durante las imágenes de rayos X.

Desgasifique todo el recipiente con una bomba de vacío para eliminar el gas agregado durante los últimos tres pasos y evitar que queden burbujas atrapadas en el gel de agar. Utilice ciclos para facilitar el escape de las burbujas. Después de algunos ciclos, si no se ven burbujas en la inspección, continúe con el siguiente paso.

Repita los últimos cuatro pasos hasta que el agar esté lo suficientemente compacto por debajo, alrededor y por encima de la muestra para evitar cualquier movimiento de la muestra. En el video complementario 1 en línea se muestra un ejemplo de agar insuficientemente compactado.

Solución de problemas

Llene el recipiente hermético hasta el tope con la solución de agar-etanol y termine de llenar con algunos cubos de agar con solución para asegurar un buen bloqueo de la muestra.

Haz un pequeño agujero de unos pocos milímetros de diámetro en el centro de la tapa.

Enrosca la tapa en el recipiente.

Si el recipiente no es directamente hermético a las fugas, use material de sellado como látex parafilm o caucho de silicona en la rosca del recipiente para asegurar un buen sellado.

Después de sellar, verifique que se eliminó todo el aire del recipiente aplicando una ligera presión sobre la tapa y asegurándose de que salga etanol por el orificio.

El agar puede bloquear el orificio y evitar que salga etanol, en cuyo caso use una aguja para limpiar el orificio.

Aplique un trozo de cinta adhesiva en el orificio de la tapa para evitar el intercambio de gases entre el interior y el exterior del recipiente y para que actúe como escape de seguridad en caso de que se formen burbujas durante el escaneado.

Aplique cinta alrededor de la tapa para protegerla y evitar que se abra accidentalmente.

Evaluar que no queden burbujas en el recipiente. Una vez que el agar es compacto, las burbujas no pueden viajar fácilmente a la parte superior.

El órgano montado se puede almacenar a temperatura ambiente durante meses o años antes de obtener la imagen, y se pueden obtener imágenes muchas veces sin ninguna intervención, siempre que no haya un evento de burbujeo debido a una dosis de rayos X demasiado alta.

Solución de problemas

Variable de tiempo según la configuración de imagen

Los parámetros de la línea de luz de todos los escaneos de órganos presentados en este documento se detallan en Datos extendidos Fig. 6. Para obtener más ejemplos de parámetros de configuración, consulte Walsh et al.36. Los pasos 37 a 43 deben ser realizados por un científico de línea de luz de sincrotrón totalmente capacitado.

En caso de órganos montados refrigerados, saque el órgano del refrigerador al menos 12 h antes del experimento y déjelo a temperatura ambiente para evitar cualquier cambio de forma durante la toma de imágenes debido al cambio de temperatura.

Coloque el órgano en su recipiente sellado en el soporte del recipiente. El portacontenedores hecho a medida que estamos utilizando se describe en Datos ampliados, Fig. 5.

Coloque un segundo recipiente equivalente (llamado recipiente de referencia) encima del recipiente de la muestra, lleno solo con los medios de montaje apropiados, como gel de agar-etanol.

Configure el detector con un tamaño de píxel que permita obtener imágenes de todo el órgano. Por lo general, para un cerebro de 14 cm con una cámara de 5056 píxeles en horizontal, se puede lograr un tamaño máximo de píxel de 27,7 µm en una adquisición normal.

Alinee el detector con el haz de rayos X.

Ajuste las rendijas de la línea de luz configurando su apertura alrededor del campo de visión.

Las rendijas bien ajustadas reducen la dosis depositada en la muestra.

Alinee la muestra con el detector y encuentre el centro de rotación.

Ajuste la energía y el flujo para garantizar una penetración suficiente a través de la muestra. La energía promedio óptima depende del tamaño del frasco que contiene el órgano. Por lo general, 80 keV para 10 cm, hasta 110 keV para 15 cm, especialmente si en las radiografías se ven partes densas como cartílagos o calcificaciones. El flujo se puede ajustar para ajustar la velocidad de exploración a los requisitos del experimento mientras se encuentra en el rango de energía correcto y se mantiene una tasa de dosis suficientemente baja para evitar burbujas.

Se debe tener cuidado con la dosis depositada en la muestra para evitar la formación de burbujas durante la exploración. Este paso debe ser realizado por un científico de línea de luz capacitado. Además, este paso depende en gran medida del tipo y tamaño de la muestra, así como de las características de la línea de luz y de la calidad de la desgasificación de la muestra.

Establece el tiempo de exposición y acumulación de la cámara. Por lo general, para una señal de cámara codificada en 16 bits, un valor máximo de píxel de 42 000 por subtrama única permite un fuerte margen de seguridad para evitar la saturación, mientras se utiliza la dinámica completa de la cámara.

Aumentar el tiempo de exposición aumenta el tiempo de barrido y por tanto la dosis depositada sobre la muestra.

Asegúrese de que la dinámica de la cámara esté optimizada y de que no se produzca una saturación del detector durante el escaneo.

Realice un escaneo del contenedor de referencia.

Escanea el órgano completo.

La configuración de la línea de luz para el escaneo de referencia y el escaneo de muestra debe ser idéntica.

Solución de problemas

Cree un campo plano haciendo un promedio de todas las proyecciones del escaneo de referencia realizado en el Paso 44.

Realice una reconstrucción de un solo corte aplicando el campo plano calculado en el Paso 46 y usando un algoritmo de retroproyección filtrada66 junto con una recuperación de fase de una sola distancia para garantizar la calidad de los escaneos (la reconstrucción se puede realizar usando una reconstrucción tomográfica de código abierto). código, como PyHST2 (ref. 67) o TomoPy68).

(Opcional) Seleccione características de interés en las imágenes reconstruidas.

(Opcional) Calcule las posiciones del motor y alinee la muestra para obtener imágenes de la región de interés correspondiente.

(Opcional) Repita los pasos 37 a 47 para obtener imágenes de regiones seleccionadas en el órgano.

Cree una integración angular parcial a partir del escaneo de referencia cada 100 proyecciones para la corrección de campo plano de radiografías de escaneo de muestra.

Aplique la corrección de campo plano en cada 100 proyecciones del escaneo de muestra con el campo plano correspondiente calculado en el Paso 50.

Reconstruya el volumen 3D utilizando un algoritmo de retroproyección filtrado junto con una recuperación de fase de una sola distancia66 y una máscara de desenfoque 2D (la reconstrucción se puede realizar utilizando un código de reconstrucción tomográfica de código abierto, como PyHST2 (ref. 67) o TomoPy68).

(Opcional) Corrija los artefactos de anillo en los cortes reconstruidos utilizando el algoritmo actualizado de Lyckegaard et al.69 (código disponible en GitHub indicado en la sección Disponibilidad de código).

Tiempo variable dependiendo de la técnica de imagen

Imagen de la muestra montada con µCT19, CT70,71 clínico o MRI63. La muestra se puede visualizar con tantas de estas técnicas de imagen como se desee.

(Opcional) Realice análisis histológicos en la muestra biológica. Utilizamos técnicas histológicas estándar, bien documentadas en Ross y Pawlina72.

Los consejos para la solución de problemas se pueden encontrar en la Tabla 1.

Paso 1, obtención de órganos: ~3 d

Paso 2, fijación del órgano: 4 d

Pasos 3–4A o 3–4B, preparación del órgano antes del montaje: 16–27 d

Pasos 5–16, preparación del gel de montaje de órganos: 12 h–2 d

Pasos 17 a 32, montaje y desgasificación de órganos: ~3 h

Pasos 33 a 53, imágenes sCT: el tiempo depende de la técnica de imagen y la configuración

Pasos 54 y 55, imágenes e histología: el tiempo depende de la técnica de imagen y la configuración

Este protocolo proporciona un método para preparar y estabilizar órganos grandes o muestras biológicas para obtener imágenes de alta resolución mediante imágenes sCT, µCT, CT clínicas o MR. Imágenes típicas de órganos humanos se muestran en las Figs. 2 y 5. Este procedimiento de preparación de muestras proporciona imágenes de alto contraste (dependiendo de la modalidad de imagen), evita el movimiento de la muestra durante el escaneo, es compatible con múltiples modalidades de imagen y conserva las características morfológicas del tejido en comparación con otros métodos de preparación de muestras como la parafina. incrustación La muestra se puede almacenar durante al menos 1 año sin movimiento ni deterioro. Este método permite la investigación en 3D de grandes estructuras biológicas, como los órganos humanos, sin dañarlos. Estas imágenes de alta resolución pueden proporcionar información cualitativa y cuantitativa sobre las características sanas o patológicas de un órgano, por ejemplo, el efecto del COVID-19 en los pulmones humanos36.

Los datos de imagen utilizados para crear las figuras presentes en este documento de protocolo están disponibles públicamente en el repositorio de datos ESRF (https://human-organ-atlas.esrf.eu) o de los autores correspondientes.

Los datos de sCT se reconstruyeron utilizando un código personalizado escrito en MATLAB 2017 disponible en GitHub (https://github.com/HiPCTProject/Tomo_Recon) y el paquete de software PyHST2 (https://software.pan-data.eu/software/74 /pyhst2). Se utilizó VGSTUDIO MAX 3.5 (Gráficos de volumen) para la representación de volumen.

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Agradecemos a S. Bayat (INSERM) por su ayuda durante la fase de prueba, P. Masson (LADAF) por las disecciones de los cuerpos de los donantes, H. Reichert (ESRF) y R. Tori por el apoyo general del proyecto y E. Boller, C Muzelle, R. Homs, C. Jarnias, F. Cianciosi, P. Vieux, P. Cook, L. Capasso y A. Mirone por su ayuda en el desarrollo y mejora de la configuración. También agradecemos a R. Engelhardt, A. Muller Brechlin, C. Petzold, N. Kroenke y M. Kuhel por su ayuda con la histología y las autopsias. Este proyecto ha sido posible en parte gracias a la subvención número 2020-225394 de Chan Zuckerberg Initiative DAF, un fondo asesorado de Silicon Valley Community Foundation y la subvención número CZIF2021-006424 de Chan Zuckerberg Initiative Foundation, las propuestas de financiación ESRF md1252 y md1290, la Real Academia de Ingeniería (CiET1819/10). PDL y CLW agradecen la financiación del MRC (MR/R025673/1). MA reconoce subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (HL94567 y HL134229). Este trabajo fue apoyado por el Registro Alemán de Autopsias COVID-19 (DeRegCOVID, www.DeRegCOVID.ukaachen.de; apoyado por el Ministerio Federal de Salud: ZMVI1-2520COR201) y el Ministerio Federal de Educación e Investigación como parte de la Red de Medicina Universitaria (DERROTAR PANDEMIas, 01KX2021).

Estos autores contribuyeron igualmente: J. Brunet, CL Walsh.

Departamento de Ingeniería Mecánica, University College London, Londres, Reino Unido

J. Brunet, CL Walsh, S. Marussi y Peter D. Lee

Instalación europea de radiación de sincrotrón, Grenoble, Francia

J. Brunet y Paul Tafforeau

Departamento de Radiología Diagnóstica e Intervencionista, Hospital Universitario de Heidelberg, Heidelberg, Alemania

WL Wagner

Centro de Investigación Traslacional del Pulmón de Heidelberg (TLRC), Centro Alemán de Investigación del Pulmón (DZL), Heidelberg, Alemania

WL Wagner

Laboratorio de Anatomía de los Alpes Franceses (LADAF), Universidad de Grenoble Alpes, Grenoble, Francia

A. Bellier

Instituto de Patología, Facultad de Medicina de Hannover, Hannover, Alemania

C. Werlein y DD Jonigk

Investigación biomédica en enfermedad pulmonar obstructiva y en etapa terminal Hannover (BREATH), Centro Alemán de Investigación Pulmonar (DZL), Hannover, Alemania

DD Jonigk

Centro de Investigación, Anatomía y Capacitación Quirúrgica de Amberes (ASTARC), Universidad de Amberes, Amberes, Bélgica

SE Pasado

Instituto de Patología y Patología Molecular, Clínica Universitaria Helios Wuppertal, Universidad de Witten/Herdecke, Wuppertal, Alemania

M. Ackermann

Instituto de Anatomía Clínica y Funcional, Centro Médico Universitario de la Universidad Johannes Gutenberg de Mainz, Mainz, Alemania

M. Ackermann

Complejo de investigación en Harwell, Didcot, Reino Unido

Pedro D. Lee

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PT, PDL, DDJ, MA, CLW y WLW conceptualizaron el proyecto y diseñaron experimentos. MA, CW, PT, AB, SEV, CLW y JB realizaron y contribuyeron a las autopsias y preparación de muestras. PT diseñó y construyó instrumentación y realizó imágenes HiP-CT. Portamuestras diseñados por SM. PT diseñó e implementó métodos de reconstrucción tomográfica. JB, PT, CLW y PDL escribieron el artículo. Todos los autores asistieron en la revisión y revisión del manuscrito.

Correspondencia a J. Brunet, CL Walsh, Peter D. Lee o Paul Tafforeau.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Protocols agradece a Ali Erturk, Stuart Stock y Hiroki Ueda por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Este protocolo se desarrolló de manera iterativa superando todos los diferentes desafíos relacionados con la obtención de imágenes de tejidos blandos, el depósito de dosis y la tomografía local.

Los datos sobre el corazón, los riñones y el cerebro están presentes en el Human Organ Atlas (https://human-organ-atlas.esrf.eu). Los datos del hígado no están incluidos en el Human Organ Atlas debido a la gran cantidad de artefactos presentes en las imágenes debido a la formación de burbujas durante la exploración. Sin embargo, las imágenes están disponibles previa solicitud a los autores correspondientes. La formación de estas burbujas se produjo porque un fallo en el software de la línea de luz hizo que el haz permaneciera en la misma posición durante varias horas, superando el umbral de dosis del órgano. Se han escaneado otros hígados sin artefactos.

El proceso descrito en este documento de protocolo debería funcionar para todos los órganos principales, pero solo se han probado los órganos enumerados aquí. Los tiempos máximos de desgasificación que se enumeran aquí son específicos de nuestra configuración de desgasificación al vacío y están sujetos a cambios según la bomba, el volumen a bombear, la sección de bombeo, la cantidad de gas a evacuar y las rutas que puede tomar el gas para dejar la muestra. Como tal, deben adaptarse a la configuración de vacío de cada usuario al observar la intensidad de burbujeo como se explica en el Paso 4A (ii) del protocolo.

El contenedor a prueba de fugas de la izquierda es un contenedor de Medline Scientific (n.º de cat. 129-0592) de 3 L. El contenedor a prueba de fugas de la derecha es un contenedor Lock & Lock (n.º de cat. INL-403) de 2,1 L. Ambos se encuentran dentro de un soporte de contenedor hecho a la medida que se describe en Datos ampliados, Fig. 5.

Dos contenedores están representados dentro del portacontenedores hecho a medida. El contenedor inferior contiene la muestra, mientras que el contenedor superior, denominado contenedor de referencia, se utiliza para la corrección de campo plano.

La configuración óptima de escaneo depende en gran medida de la muestra y de la configuración y el equipo de la línea de luz. Los parámetros presentados aquí se dan como ejemplos. La adquisición de un cuarto significa un escaneo en la mitad de la adquisición más un escaneo anular para aumentar el campo de visión lateral. Mo = molibdeno.

Ejemplo de muestra montada con agar insuficientemente compactado, que permite la rotación con un ligero movimiento.

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Reimpresiones y permisos

Brunet, J., Walsh, CL, Wagner, WL et al. Preparación de grandes muestras biológicas para tomografía de contraste de fase sincrotrón jerárquica de alta resolución con compatibilidad de imagen multimodal. Protocolo Nacional 18, 1441–1461 (2023). https://doi.org/10.1038/s41596-023-00804-z

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Recibido: 21 junio 2022

Aceptado: 12 de diciembre de 2022

Publicado: 01 marzo 2023

Fecha de emisión: mayo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41596-023-00804-z

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